山东师范大学隋娜教授课题组m6A论文4连发！| m6A专题

目前已经鉴定出超160种RNA上的修饰，如m7G, m6A, m5C等等，这些修饰在调节RNA命运阶段发挥着重要的作用。其中m6A是最常见的真核mRNA修饰类型，并且已在许多生物中发现。有研究表明，m6A修饰在调节植物生长发育以及抗逆性等生物学过程中发挥重要作用。m6A修饰的关键组分包括Writers，Readers和Erasers，其中任何一个组分的功能丧失都会导致植物m6A修饰总体水平发生变化，以及生长发育的异常或抗逆能力的改变。因此通过调控m6A修饰水平，可能在提高作物产量、改善作物品质以及提高植物抗逆性方面存在巨大潜力。

2020年联川生物合作伙伴山东师范大学隋娜教授团队发表了4篇当前热门的m6A研究文章，其中综述3篇，实验性论文1篇，这几篇文章系统阐述了m6A修饰的关键酶组分及其作用机理，梳理并比较了目前最新的m6A检测技术，提出了在植物系统中建立m6A编辑平台以达到单碱基识别m6A修饰位点的目的，并利用CRISPR技术对m6A修饰位点进行选择性编辑，达到改良作物特性的观点。随后，隋娜教授团队进行了一项实验性研究，对两种基因型甜高粱的耐盐性与m6A修饰之间的相关性进行了研究，评估其耐盐性与m6A水平的关系。

隋娜教授长期致力于植物逆境生理及分子生物学研究，该团队围绕甜高粱、玉米等植物的抗逆机理及分子机制进行了一系列研究，在《Trends in Plant Science》、《Molecular Plant》、《Biotechnology Advances》等刊物发表SCI论文60余篇，SCI他引800余次；授权国家发明专利2项；主持国家自然科学基金项目4项，主持其他国家及省部级项目20余项。

以下为隋娜教授团队4篇m6A相关文章的概要：

2020年4月，文章发表于Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF：5.186）：Functional Implications of Active N6-Methyladenosine in Plants。文章系统性地总结了植物中m6A的组成和作用机理研究的最新进展，特别是m6A修饰对RNA命运、植物发育和抗逆性的重要作用；并讨论了植物中m6A修饰未来研究中存在的突出问题和机遇。

2020年5月，文章发表于Trends in Plant Science（IF：14.416）：m6A editing: New tool to improve crop quality？文章提出通过在植物系统中建立m6A编辑平台，利用高通量表观转录组测序的方法以单碱基分辨率识别m6A修饰位点，并利用CRISPR技术对m6A修饰位点进行选择性编辑，进而达到改良作物、提高作物抗逆性的观点。

2020年11月，文章发表于Biotechnology Advances（IF：10.744）：Advances in the profiling of N6-Methyladenosine (m6A) modifications。本文系统性盘点了目前最新的m6A检测技术，并对不同技术进行了全面的比较。文中还讨论了如何利用m6A预测器以及m6A公共数据库选择合适的m6A检测方法，并利用m6A编辑技术进行相关试验的设计。

2020年12月，文章发表于Plant Science（IF：3.591）：Analysis of N6-methyladenosine reveals a new important mechanism regulating the salt tolerance of sweet sorghum。本研究对两种基因型甜高粱的耐盐性与m6A修饰之间的相关性进行了研究，结果表明耐盐基因转录本上m6A修饰的数量和程度可能是确定和评估农作物耐盐性的重要因素。

下面跟着小编一起来看看这几篇文章的核心内容，相信通过这几篇文章，大家将会对m6A修饰及其在植物中的作用有一个更加深刻的认识。需要原文的小伙伴也可以在后台留言“m6A4”索取原文详细阅读哦~

文章1

Front Cell Dev Biol：m6A修饰在植物中的功能

m6A修饰是最常见的转录后修饰，对RNA的输出，剪接，稳定性和翻译具有重要的调节作用。m6A在RNA上的丰度取决于甲基转移酶（Writer）和脱甲基酶（Eraser）之间的动态调节，而m6A结合蛋白（Reader）通过结合RNA上的m6A修饰位点发挥更具体的调节功能。Writer和Eraser负责分别向保守序列RRACH添加或去除m6A。Reader负责结合m6A位点，并对修饰的RNA发挥特定的调控作用。Writer, Eraser, Reader构成了m6A修饰调控网络的基础。但是，并非所有包含RRACH序列的RNA都能被m6A修饰。因此，更多与m6A相关的酶的发现和功能研究有助于了解m6A修饰以及调控的机制。

在动物系统中，m6A writers主要有METTL3, WTAP和 METTL14，这些writers通常以复合物的形式在RNA上添加m6A修饰；m6A erasers主要有FTO和ALKBH5，它们负责擦除RNA上的m6A位点。m6A修饰的添加和移除在细胞中是动态且可逆的过程。readers主要有包含 YTH 结构域的YTHDF2 (DF2) 和 YTHDF3 (DF3), HNRNPA2B1以及真核转录起始因子 3 (eIF3)。这些readers通过识别RNA上特定的m6A修饰位点，进而调控RNA代谢过程。值得强调的是，m6A系统中的核心酶在不同物种之间是高度保守的，因此研究动物或模式植物中m6A的调控模式也应有助于我们探索其在植物及作物中的调控模式。

图1.植物m6A系统的主要组件包括Writers, Erasers, Readers

有研究发现m6A系统的关键组成基因主要集中在分生组织和生殖器官中，而在停止分化和成熟的组织中表达较低。这表明在转录活跃的基因上更可能发生m6A修饰。此外，在植物中mRNA，rRNA，tRNA和sn（o）RNA上也检测到m6A修饰。

在哺乳动物中，m6A修饰在调节RNA剪接，RNA稳定性，RNA输出，3’UTR加工，翻译和miRNA加工中起着重要作用，而关于m6A修饰植物上RNA的功能的了解甚少。

对m6A调控RNA命运的了解仅限于它是mRNA稳定标记。

图2.N6-甲基腺苷在植物中的功能

目前，大多数植物系统中的m6A修饰都是通过m6A-seq方法检测的。但是，这种方法存在一些局限：例如需要大量样品，对抗体质量要求高以及无法准确定位m6A修饰在RNA上的位置。尽管对m6A-seq的分辨率进行了一些改进，包括m6A单核苷酸分辨率的交联和免疫沉淀（miCLIP），光交联辅助的m6A-seq（PA-m6A-seq）和m6A-交联免疫沉淀法（m6A-CLIP）【文章2中详述了这几种方法的优缺点及相关应用】，但这些改良方法尚未在植物中进行测试。此外，m6A修饰主要集中在分生和生殖器官中，这表明m6A修饰更可能发生在活跃转录的基因上，而这些部位或组织的样本量通常很小，并且m6A-seq方法无法准确检测组织或细胞中的m6A修饰并进行生物学重复，因此，有必要开发新的m6A检测方法，特别是减少样本量和改进检测方法提高检测准确度，必须在细胞水平上准确鉴定m6A修饰。

与基于NGS或PCR扩增的检测方法相比，直接检测RNA上m6A修饰的技术包括单分子实时（SMRT）和单分子纳米孔测序，具有巨大的潜力。由于不需要PCR扩增，不会产生碱基错配和PCR偏倚，并且有可能同时检测多种类型的RNA修饰，且仅需要较低的样品起始量。纳米孔测序是目前为止非常适合研究小分子样品，并有可能加速对RNA修饰的生物学功能研究的方法。

m6A酶在m6A调节系统中起着基础作用。然而，迄今为止，在植物中发现的m6A酶的数量相对于在动物中的数量小，并且在动物中未发现主要脱甲基酶FTO的同源物。仅发现了ALKBH家族的一种脱甲基酶，目前尚不清楚ALKBH家族的蛋白是否可以完成mRNA上m6A位点的去除。因此，找到m6A系统的更多关键组件也非常重要。此外，尚不清楚Writers和Erasers如何选择性地在RNA上添加或去除m6A，这可能与RNA的特殊二级结构有关。低温电子显微镜和分子成像可能有助于探索m6A选择性修饰的过程。

探索m6A修饰功能的主要方法仍是通过遗传干扰。但是，添加或去除m6A的任何关键组件对植物的影响可能远远超过人们所关注的范围。因此，在不改变核苷酸序列和总体m6A修饰水平的情况下探索RNA甲基化的发展，可能是将来探索m6A的功能重要途径。CRISPR–Cas9技术正在迅速发展，并实现了精确的基因组编辑，包括靶向DNA切割，修复，直接碱基编辑和位点特异性表观基因组编辑。最近，研究人员使用了类似的方法将m6A Writers和Erasers与Cas蛋白融合在一起，并在sgRNA和PAMer的指导下编辑细胞中特定mRNA的m6A修饰【文章3中详述了m6A编辑对解决分辨率的重要作用】。这种编辑m6A的方法没有改变核苷酸序列和总体m6A修饰水平。该方法为研究m6A修饰的生物学功能提供了新的工具，并使得可以在特定位置编辑m6A以改善作物质量。

文章2

Biotechnol Adv：m6A研究方法最新进展及实验设计

自2012年两个独立课题组分别发表了m6A-seq和MeRIP-seq的方法后，m6A-mapping的方法不断发展。大量m6A-mapping开始揭示转录组范围内哪些转录本受m6A调控，以及m6A如何在多种细胞环境中调控基因表达，表观遗传组的概念被人们广泛接受。同时，基于CRISPR技术的m6A编辑技术也为这个领域注入了新的活力【文章3中详述了m6A编辑对解决分辨率的重要作用】。

NGS的发展为鉴定低丰度RNA修饰和探索RNA修饰的生物学功能提供了强大的工具。但是，要获得m6A修饰和基因表达之间关系的详细模型，仍然是极具挑战性的。m6A作为目前研究最广泛的RNA上的修饰，其检测方法相对成熟。在最近几年中，通过免疫沉淀、代谢物标记、酶介导的突变等方法，结合NGS的策略在转录组范围内检测m6A修饰的技术已经取得了进步。另外，单分子实时测序（SMRT）和纳米孔直接测序（Nanopore DRS）的方法也为单细胞水平更直接检测RNA上的修饰提供了新的方向。根据检测水平的不同，主要可分为三大类：总体m6A修饰水平的检测、特殊位点的m6A检测，以及转录组范围内的m6A检测。本文根据检测水平的不同，对不同检测方法的原理、样本要求、难度、花费时间等条件进行了全面的比较。

文章中介绍了覆盖几乎所以的m6A检测方法，包括基于m6A抗体的检测方法：m6A-seq、MeRIP-Seq、meRIP-qPCR、PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP等方法。基于消化的检测方法：基于液相色谱质谱仪（LC-MS）、薄层色谱（TLC）、以及MazF酶消化的MAZTER-seq和m6A-REF-seq等方法。基于m6A感应逆转录（RT）的检测方法：HTS和m6A-4SeT等方法。基于连接的检测方法：筛选DNA连接酶扩增连接的m6A修饰的DNA产物来检测特定的转录本。基于基因编辑的检测方法，DART-seq，通过APOBEC1胞嘧啶脱氨酶将胞嘧啶脱羧成尿嘧啶，m6A reader的YTH蛋白家族选择性地与m6A修饰位点结合，当APOBEC1和YTH融合时，APOBEC1可以在YTH域的帮助下定位m6A位点。以及还有相关的基于代谢标记的检测方法，基于直接RNA的检测方法和基于计算的方法的简要概述。

图3.基于抗体的m6A检测方法

图4. 基于限制性内切酶消化的m6A检测方法

然而对于m6A领域的研究者而言，以上m6A修饰位点的检测通常只是m6A功能研究的第一步。在之前的研究中，通常是利用敲除/过表达m6A修饰酶的方式研究m6A修饰的功能。然而这会引起转录组范围内的m6A修饰改变，产生无法预料的影响，并且难以研究特定RNA上m6A修饰的功能。m6A修饰编辑工具的出现是m6A修饰研究领域革命性的技术进步，这将很大程度上改变研究人员对m6A修饰的研究方式及实验方案的设计【文章3中详述了m6A编辑对解决分辨率的重要作用】。

得益于m6A检测方法的进步，尤其是近两年来，m6A修饰的公共数据集正快速积累。利用公共数据作为训练集，对m6A位点周围的序列和结构特征进行整合，研究者已经开发出了许多基于RNA序列的m6A修饰预测器。同时，整合的公共数据库通过对已有数据集的处理和注释，能够最大可能的降低批次效应带来的影响。这些公共数据集通过与（GWAS）数据、ClinVar的数据、RNA结合蛋白（RBP）数据等相关联，能够辅助研究人员发现隐藏在这些数据中的RNA修饰的潜在功能，探究m6A与RBP之间的关系，m6A与疾病之间的关系。恰当的利用这些预测器和公共数据集，将帮助研究人员特别是新来者或跨领域人员在前期工作中大大降低成本，并辅助进行合适的实验方案选择（图5）。

图5. 利用预测器和公共数据库进行m6A功能研究的实验设计

文章3

Trends Plant Sci：m6A编辑改良作物品质及抗逆性

作物改良是应对全球气候变化和人口增长的永恒主题，但是任何单一策略对作物品质的改良都是有限的。因此，未来作物的改良必然是针对包括生理学，遗传学，表观遗传学以及植物与环境之间相互作用等多种因素相结合的改良策略。作为基因表达过程中重要的调控途径，动态可逆的m6A修饰是调控基因表达的一条新途径。

然而，由于研究RNA上表观修饰的RNA工具的局限性，关于m6A在植物中功能的研究都是使用了遗传干扰的方法。但是m6A修饰系统中任何关键组分的缺失都会导致植物中m6A修饰的总体水平发生变化，可能产生观测结果之外的影响。因此，有必要在不改变m6A修饰整体水平的条件下进行特定位点的m6A编辑，以探索植物中特定位点m6A修饰的功能，进而未来用于作物的改良。

最近报道的利用m6A修饰酶与CRISPR/Cas 9系统相融的技术，提供了一种在细胞中编辑特定位点m6A修饰的方法。尽管到目前为止，该方法仅在动物细胞及体外实验中进行了测试，但现有证据表明m6A编辑在植物中是可行的。因此，通过在植物系统中建立m6A编辑平台，以研究特定m6A修饰位点的功能并提高作物产量、改善品质和提升抗逆性是有必要的。总体而言，该平台在植物系统中主要包含以下几个关键步骤：

首先，以纳米孔测序等高通量技术手段，以单碱基分辨率下标记RNA上可能在植物生长发育或抗逆性中起重要作用的m6A位点，作为潜在的改良靶点。

然后，通过m6A编辑系统添加或删除特定位点的m6A修饰获得编辑突变体。

最后，选择与野生型相比具有更好农艺性状的m6A编辑的突变体，作为育种材料。

图6.m6A植物编辑平台流程

文章4

Plant Science：m6A-seq分析揭示调节甜高粱耐盐性的重要机制

甜高粱是一种能源和饲料作物，非常适合在盐碱地上生长。探索甜高粱中的m6A修饰对于阐明农作物的耐盐机制很重要。本研究绘制了m6A修饰在两种基因型高粱（耐盐的M-81E和盐敏感性Roma）中耐盐性相关的图谱，以期揭示甜高粱耐盐性与m6A修饰之间的潜在关系。

本文将NaCl处理和空白对照的高粱根每组取样2份混合，每个样本两个生物学重复，对获得的8个样本进了m6A-seq和RNA-seq。对获得的测序数据进行了分析。在M_CK和R_CK中检测到4155个peak，对这些共有的m6A peak相对应的基因进行GO分析，结果表明，这些基因中常见的m6A peak高度富集在转录调节，氧化还原过程，对镉离子转录的响应，盐胁迫的响应，糖酵解过程，蛋白质磷酸化，翻译，对寒冷的响应，对脱落酸的反应，胚胎发育终止于种子休眠，蛋白质折叠，细胞内蛋白质转运以及对缺水的反应等。而这些生物过程中的许多都与生长，发育和对环境压力的反应有关，这可能反映了对周围复杂土壤环境的反应的特定根系活动。这一结论也与文章2和文章3中的结论一致，即m6A修饰发生在生长发育旺盛的组织。更有趣的是，m6A peak富含胚胎发育相关基因的转录本，表明哺乳动物和植物的胚胎发育均需要m6A修饰的参与。

注意：

M_CK代表M-81E空白对照；M_S代表M-81E盐胁迫处理；

R_CK代表Roma空白对照；R_S代表Roma盐胁迫处理；

图7

为了确认不同基因型之间显著差异的m6A peak，分析了M-81E和Roma中最重要的1000个peak（图8c），且在M-81E的5'UTR中检测到了比Roma更重要的m6A peak。为了评估m6A修饰区域中的多样性对甜高粱中mRNA的影响，进一步分析了m6A修饰特定区域后的mRNA水平。5'UTR区的m6A修饰导致最高的mRNA水平，接着是3'UTR的修饰，然后是CDS区的修饰（图8d）。基因在不同基因型或品种的植物中的差异表达是造成植物耐盐性变异的主要因素之一。结果表明，具有明显m6A peak的区域中的差异可能是M-81E和Roma差异基因表达的原因。M-81E中5'UTR区的m6A修饰程度大于Roma，这可能与M-81E中转录和翻译的增加有关。

图8

利用exomePeak处理数据并获得有关盐胁迫的m6A peak信息，发现M-81E的m6A修饰几乎没有变化。随后，比较了M_CK和M_S根样本中的m6A修饰。数据表明，M_S和M_CK样本之间有80.9％的m6A peak重叠。为了探索m6A peak变化与基因表达变化之间的关系，比较了m6A peak和mRNA丰度具有显著差异的基因（图9b，9c）。结果表明，m6A peak变化与基因表达变化之间的重叠较少，表明m6A调节RNA命运的修饰很复杂，而不是简单地升高或降低转录组内的mRNA丰度。对m6A差异peak基因的KEGG分析表明，m6A差异peak主要集中在与基本细胞代谢有关的基因，例如苯丙烷类生物合成，嘌呤代谢和嘧啶代谢。DEG主要集中在与植物激素信号转导相关的基因上。

图9

通过比较GO注释中M_CK和M_S中m6A修饰的基因，发现二者之间的m6A修饰和基因表达差异相对较小。该观察结果与先前研究中的生理数据一致，后者显示M-81E受150 mM NaCl的24小时处理影响不大。这些结果表明，由于在150 mM NaCl中暴露24小时，M-81E中的m6A修饰就可以维持该基因型的耐盐性。因此，与M-81E的比较可能对研究盐敏感性基因型Roma中盐诱导的m6A修饰的动态变化具有重要意义，并且对于阐明Roma中m6A修饰的变化可能产生的生物学效应可能是有用的。

与M-81E的数据相反，在Roma处理组中观察到了m6A修饰的重大变化，且R_S中的m6A修饰几乎是R_CK中的两倍。通过比较m6A peak和mRNA丰度具有显著差异的基因，KEGG分析显示，差异m6A peak主要集中在与淀粉和蔗糖代谢，过氧化物酶体和核苷酸切除修复相关的基因上。DEG主要集中在与淀粉和蔗糖代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢，氧化磷酸化以及糖酵解/糖异生有关的基因。此外，GO分析这些基因高度富集：调节转录，氧化还原过程，蛋白质磷酸化，防御反应，碳水化合物代谢过程以及对盐胁迫的反应。这些结果与以前的拟南芥研究相似，证实了盐相关的转录本会响应盐胁迫而经历m6A修饰。因此，Roma的m6A修饰的变化可能会积极影响盐胁迫反应。

在分析Roma的m6A修饰具有显著变化的转录本时，发现了一个有趣的现象：m6A修饰显著增加的耐盐相关基因的某些转录本同时在mRNA丰度上也显著增加（表1）。为了探讨m6A是否通过影响mRNA的稳定性来调节RNA丰度，用转录抑制剂虫草素和放线菌素D处理了R_CK和R_S 0h和24 h。然后，使用qRT-PCR计算了处理后24h初始转录本的百分比。对mRNA稳定性的研究表明，对这些关键的耐盐转录本进行m6A修饰可提高mRNA的稳定性，从而导致mRNA丰度增加（图10b）。

图10

为了探索M_CK和R_CK之间m6A修饰差异的潜在影响，比较了差异表达的基因和M_CK与R_CK之间的m6A差异peak（图11a，b）。M-81E和Roma基因型在m6A修饰方面的差异远大于基因表达方面的差异，这表明相对于差异基因，m6A修饰的差异可能在维持M-81E和Roma之间的耐盐性差异中起着更为重要的作用。为了探讨盐胁迫下M-81E和Roma m6A修饰的功能。对与M_CK，M_S，R_CK和R_S中的m6A修饰基因相对应的基因进行了GO分析（图11c）。耐盐基因型M-81E在盐胁迫下m6A修饰的变化很小。然而，在盐敏感性基因型Roma中，m6A修饰发生了很大变化，R_S中的m6A修饰类似于M-81E。与R_CK相比，大多数M_CK，M_S和R_S基因的GO term来自细胞成分，分子功能和生物学过程类别。具体来说，高丰富的生物学过程GO term为DNA模板的转录调控，转录，DNA模板，蛋白质磷酸化，氧化还原过程，防御反应，对脱落酸的反应，对盐胁迫的反应。

图11

上述结果表明，在不同基因型的甜高粱中，在维持耐盐性中发挥积极作用的m6A修饰基因似乎是固定的。接下来，比较了M_CK和R_CK中m6A峰和mRNA丰度具有显著差异的基因（图11d）。KEGG分析表明，差异m6A peak主要集中在与氧化磷酸化，淀粉和蔗糖代谢有关的基因上。DEGs主要集中在与植物病原体相互作用，苯丙烷生物合成以及氨基糖和核苷酸糖代谢有关的基因上。这些经过m6A修饰的基因可能能够准确有效地缓解盐，渗透和氧化胁迫的不利后果，并导致M-81E和Roma盐耐性的差异。

真核生物中m6A修饰的程度主要受甲基化酶和脱甲基化酶的调控。Anderson等人的m6A-seq结果揭示了拟南芥的mta突变体比野生型对照具有更少的m6A修饰。通过BLAST搜索确定了主要的甜高粱甲基化酶基因SbMTA，SbMTB，SbFIP37和SbMTC以及主要的ALKBH脱甲基酶家族成员。此外，还验证了RT-PCR分析中盐胁迫诱导的这些基因表达的变化。在盐胁迫条件下，M-81E中甲基化酶和脱甲基化酶基因的表达水平没有显著变化。相反，在盐胁迫下，Roma的主要甲基化酶基因（SbMTA）的表达被上调，而ALKBH脱甲基化酶基因家族的表达被下调。该结果与mRNA-seq中的基因表达趋势一致。甜高粱根中主要甲基化酶和脱甲基化酶基因表达水平的变化表明，盐胁迫不会影响M-81E中m6A的修饰，而通常会增加Roma中m6A的修饰。这些观察结果与m6A-seq分析中揭示的m6A peak的数量和范围的变化一致。

综上，本研究发现盐胁迫下甜高粱的m6A修饰发生了显著变化，特别是在Roma品种中，一些耐盐相关转录本的mRNA的m6A修饰增加，导致mRNA的稳定性增强，进而参与了耐盐性的调控。尽管m6A修饰对于调节甜高粱盐耐性很重要，但其调节活性受到初始m6A修饰水平的限制。另外，在M-81E和Roma中，m6A修饰的差异远大于基因表达水平的差异，并且更加敏感。研究结果表明，耐盐基因转录本上m6A修饰的数量和程度可能是确定和评估农作物耐盐性的重要因素。

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